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動物實驗方案設計

時間:2022-07-03 14:52:33 輔助設計與工程計算 我要投稿
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動物實驗方案設計

  動物實驗指在實驗室內,為了獲得有關生物學、醫學等方面的新知識或解決具體問題而使用動物 進行的科學研究。以下小編為你整理了動物實驗方案設計,希望對你有所參考幫助。

動物實驗方案設計

  一、實驗設計的基本要素和原則

  實驗設計就是擬定實驗方案,在進行科學研究時,對研究方案作合理的安排,以減少隨機誤差的影響。采用適當的研究實驗次數,減少實驗的成本并能對數據進行有效的分析,提高實驗研究的可靠性,從而實現研究的目的。

  研究設計包括專業設計與統計設計兩個部分。統計設計主要是依據研究目的,從研究的現況條件出發,規定研究因素、選擇效應指標、確定研究對象的引入方式方法和規模,擬實施的方法、方案,及數據收集、整理分析的模式,直至結果的解釋,進行系統的安排,使其消耗最少的人力物力和時間,而獲得可靠的信息與結論。

  1.實驗設計的基本要素

  實驗設計的基本要素為:實驗單位、處理因素和實驗效應。

  (1)大多數情況下,實驗單位等同于實驗對象、受試對象,在動物實驗中的動物即為實驗單位。

  (2)處理要素:是研究者根據研究目的施加于實驗單位,在實驗中需要觀察并闡明其效應的因素,是實驗單位分組的標志。而非處理因素則是指實驗中非人為施加的、與處理因素同時存在,同樣可以使受試對象產生實驗效應的因素,如實驗動物的雌雄、體重等因素。突出研究因素的主導作用,排除混雜因素的干擾作用,可以通過相應的實驗設計方法,盡量使非處理因素在各處理組中的分布達到一致或均衡,以便分離出處理因素的效應。另外,處理因素的施加方法、強度、頻率和持續時間等,在整個實驗中應始終保持不變,以保證實驗結果評價的可靠性和穩定性;處理因素作用于受試對象的反應,是研究結果的最終體現,其基本要求客觀性、特異性、靈敏性和精確性。

  (3)實驗效應:處理因素作用于實驗動物后,出現實驗效應,一般是用各種指標來反映的。指標按其性質可分為計數(含等級)指標和計量指標,計數指標如“是”“否”“有”“無”,“陽性”“陰性”,“痊愈”“顯效”“好轉”“無效”,“存活”“死亡”等。計量指標指可測量(含間接測量)的指標,如很多檢查和檢驗指標。

  在對指標進行觀察時應注意:

  ①實驗效應的觀察應避免偏性。研究者的心理往往偏于陽性結果,為了消除或減少測量偏差,設計時常采用盲法。

  ②應注意處理和效應的關系:處理與效應之間存在一定的關系,如劑量反應曲線。做實驗應選擇一個合適的實驗劑量。

  2.實驗設計的基本原則

  實驗設計的三大原則即為重復(replication)、隨機化(randomization)和對照(control),這是藥理實驗設計的基本要求。其目的是排除非處理因素的作用,控制隨機誤差,避免系統誤差,提高實驗效率。

  (1)重復原則(重復穩定性):能夠充分重現的實驗,才能稱為可靠的實驗。另外,實驗研究應有一定數量的重復觀測結果,即實驗單位要達到一定數量。避免將個別情況誤認為普遍情況,將偶然誤認為必然,將實驗結果錯誤推廣,同一實驗條件下、同一觀測指標的多次測量會有變異,多次測量才能描述變異,估計隨機誤差。實驗單位足夠多時,才能獲得隨機誤差比較小的統計量。重復的目的是估計和控制實驗中的隨機誤差,提高實驗結果的可靠性。樣本中包含的實驗單位數稱為樣本含量(樣本量)。重復原則的應用就是樣本含量的估計。

  首先要考慮實驗要有足夠的例數,能準確重復再現,同時盡可能排除對實驗的干擾,它包括:①動物方面,如品種、品系、體重、年齡、性別、飼料及飼養環境等;②儀器方面:準確性、穩定性、電壓穩定性及操作熟練程度等;③藥物方面:性能、批號、純度、劑量和注射速度等。此外還有室溫、氣壓、季節等物理因素,甚至實驗是在上午還是下午,動物群養或單養等,均應預先考慮清楚,做好設計。

  (2)隨機化原則:其目的是一切干擾因素分配到各組時只受純機遇的抽樣誤差的影響,避免受實驗者主觀因素的干擾,減小或避免偏性誤差,是實驗設計中的重要原則之一。隨機化手段可采取隨機數字表或小計算機上的隨機數字鍵。

  在實驗分組時,每個受試對象均有相同的概率或機會被分配到實驗組和對照組。隨機化是一種實驗設計的分組程序,而非“隨便”、“隨意”和“非選擇性”。隨機化的意義是保證各種非處理因素在各個實驗組和對照組達到均衡,從而顯現處理因素的作用,避免各種主、客觀因素可能導致的偏性,減少系統誤差,提高研究結果的效度。隨機化分組是從假設檢驗結果推論因果關系的基礎,確定處理因素與實驗結果之間因果關系的前提是隨機分組后、施加干預前,所有觀察對象都屬于同一個總體。

  (3)對照原則:確定實驗組時,同時設立對照組,即不施加處理因素的實驗組,只暴露于非處理因素。對照組除沒有處理因素外,其他對實驗結果可能有影響的因素(已知、可控的非處理因素)都應該與實驗組盡量相同。

  常用的對照形式,分為空白對照(blank control)、實驗對照(experimental control)、標準對照(standard control)、相互對照(mutual control)、潛在對照(potential control)。空白對照即對對照組不施加干預,對照組的處理因素為“空白”;實驗對照即對照組不施加干預,但施加某種與處理因素有關的實驗因素,用于處理因素的施加需伴隨其他因素,而這些因素又可能影響實驗結果時;標準對照組的干預采用現有“標準”方法或常規方法,主要用于臨床試驗,當倫理上不允許對對照組患者采用空白對照或假干預,如新藥研究采用目前療效確定的藥物作為對照藥;相互對照則不專門設立對照組,各實驗組間互為對照,如比較幾種同類藥物的療效差別:潛在對照也不用專門設立對照組,以過去的研究結果為對照(歷史對照)。另外,當實驗組和對照組例數相等時,統計學證明其統計效率最高,輕視對照或對照較少是錯誤的和不妥當的。

  二、抽樣和分組

  抽樣和分組必須嚴格遵守隨機原則,主要因素要均衡一致,但抽取哪一只動物。分配到哪一組則按隨機數字表或鍵而定。如果隨意拿取動物,先取到的為第一組,依次遞推,則反應活潑敏捷不易抓到的動物勢必集中到最后幾組,各組的條件就有了偏性誤差。為此,下面介紹幾種主要的分組實驗設計方法。

  1.完全隨機設計

  完全隨機設計(completely random design)亦稱單因素設計,即將受試對象隨機分到各處理組中進行試驗觀察,或分別從不同總體中隨機抽樣進行對比觀察。它適用于兩個或兩個以上樣本的比較,各組間樣本量可相等,也可不相等,但是樣本相等時統計分析效率較高。

  例1.將12只動物隨機分配到A、B兩組。

  (1)先將12只動物編號為1、2……12號,然后在隨機數字表內任意確定一個起始點和方向連續取12個隨機數字,并依次抄錄于動物編號下。

  (2)本例從隨機數字表第6行第19、20列起向下讀取12個隨機數字,取兩位隨機數字(表4-1)。

  (3)將隨機數字從小到大順序排列后得序號R,并規定R=1~6者為A組,R:7~12者為B組。

  表4-1  12只動物完全隨機分兩組結果(采用隨機數字表)

  例2.將15只動物隨機分成三組。

  (1)將動物編號如1、2……15號,然后在隨機數字表內從某行某列起向某方向讀取15個隨機數字,取兩位隨機數字,依次抄錄于動物編號下。

  (2)將隨機數字從小到大順序排列后得序號R。

  (3)規定R=1~5者為A組,R=6~10者為B組,R=11~15者為C組。

  (4)本例從隨機數字表第5行第17、18列起向下讀取15個隨機數字(表4-2)。

  表4-2  15只動物完全隨機分三組結果

  注:隨機數字06之后隨機數字為02,但前面已經出現過,故舍去。

  隨機分組應注意:

  (1)隨機數的位數不應小于N的位數:

  (2)隨機數如果有重號數字應舍棄:

  (3)若科研上需要各組例數不等可利用序號(R)調整各組例數。如在例2中要求A組6例,B組5例,C組4例,可規定R=1~6者為A組,R=7~11者為B組,R=12~15者為C組。

  統計假設檢驗方法:

  (1)計量資料:t檢驗、方差分析或秩和檢驗等;

  (2)計數資料:卡方檢驗等。

  完全隨機設計的優缺點:設計及統計分析簡單。但是,實驗效率不高,只能分析單因素。

  2.配對實驗設計

  將受試對象按某些特征或條件配成對子,然后分別把每對中的兩個受試對象隨機分配到實驗組和對照組,再給予每對中的個體以不同處理,連續實驗若干對,觀察對子間的差別有無意義。

  配對設計的特征或條件:

  動物實驗常以種屬、品系、性別相同,年齡、體重相近的兩只動物配成對子;臨床療效觀察常將病種、病型、族別、性別相同,年齡相差不超過2~3歲,生活習慣、工作環境等相似的患者配成對子;進行配對設計時應注意不要“配對過頭”。例如,研究高血壓與鈉鹽攝入量的關系,如果將高血壓患者與非高血壓患者按飲食習慣配對后比較鈉鹽攝入量,由于飲食習慣與鈉鹽攝入量關系密切,可能會掩蓋病例與對照在鈉鹽攝入量上的差異;實驗者必須在整個研究過程中,始終能辨認屬于同一對子的是哪兩只動物,因此動物編號是非常重要的;記錄實驗數據應保持每對的一一對應關系,不能錯亂或缺失。計算每對實驗數據的差值時,順序應當一致。

  例:取20只小鼠,按性別、體重、窩別配成10對,試將其分配到實驗組與對照組中去。

  先按配對條件配對,并將對子編號,如1.1、1.2、2.1、2.2……10.1、10.2,然后再在隨機數字表上任意指定行列及查找方向,將隨機數字依次抄寫在“對子號”下。

  事先規定,遇單數定為AB順序,遇雙數定為BA順序。

  本例:從隨機數字表中第46行31、32列向右查找隨機數字(表4~3)

  表4-3  20只動物完全隨機分三組結果

  常用統計假設檢驗方法

  計量資料:配對t檢驗、配對符號檢驗、wilcoxon符號秩檢驗。

  計數資料:卡方檢驗、一致性檢驗等。

  配對實驗設計的優點:配對設計可做到嚴格控制非處理因素對實驗結果的影響,同時使受試對象間的均衡性增大,因而可提高實驗效率。它與成組的完全隨機設計相比較,可克服受試對象間由于遺傳因素的差異所引起的偏差,同時還可以減少樣本含量。

  3.交叉實驗設計(以藥理實驗為例)

  是在自身配對設計基礎上發展的雙因素設計,可在同一對象身上觀察兩種處理的效應,并能減少誤差,提高檢驗效率。

  例如:研究A藥治療高血壓的療效,以傳統的抗高血壓B藥物作對照。經隨機化將實驗動物分為兩組,一組先給A藥后再給B藥,另一組先給B藥后再給A藥。第一、二階段均為一個月,一、二階段之間的間歇期為一周。結果見表4-4:

  表4-4  兩種藥物治療高血壓的交叉實驗

  4.析因實驗設計(factorial design)

  析因設計是一種多因素多水平交叉分組進行全面實驗的設計方法,將兩個或多個實驗因素的各水平進行實驗。

  例如:2個因素同時進行實驗,每個因素取2個水平,實驗的總組合數有22=4個(表4-5);如果每個因素取3個水平,則總組合數有32=9個,即這9種組合都要進行實驗,故一般采用簡單的析因實驗設計。

  析因設計可以提供三方面的重要信息:各因素不同水平的效應大小;各因素間的

  表4-5 2×2析因設計

  交互作用;通過比較各種組合,找出最佳組合。如果在一次實驗中,當一個因素的水平間的效應隨其他因素的水平不同而變化時,因素間存在交互作用,它是各因素效應間不獨立的表現。

  5.正交實驗設計

  正交設計適用于多因素分析,可算出各因素不同水平對實驗的影響,找出最佳組合。現以L4(23)及L9(34)正交設計結合例子簡單介紹(L表示正交設計,4或9表示分4組或9組,23表示3個因素2個水平,34表示4個因素3個水平)。

  例1  營養液中有三個因素(Ca2+,K+,Mg2+),各有2個水平(高濃度、低濃度),要分析它們對實驗的影響,找出最佳組合,可設計如下表4-6:

  表4-6 L4(23)正交設計

  表中Ca2+的1水平之和為8.6+6.2=14.8,K+的1水平之和為8.6+9.7=18.3…。可以看出,Ca2+的差值絕對值最大,說明Ca2+對實驗影響最大,且低濃度好。K+的影響次之,高濃度好。Mg2+的影響最小,高濃度好。結論是以低Ca2+,高K+,高Mg2+為最佳組合。但是,這一組合在實驗中并未出現,但正交設計提示這是最佳組合,可安排復試加以驗證。

  例2  四種藥物各有三個水平,用L9(34)正交設計,見表4-7:

  由表中可以看出甲藥影響最大,應列為主藥,大劑量較好。乙、丙、丁三藥影響較小,可列為輔藥,最佳組合為甲藥大劑量,乙藥大劑量,丙藥小劑量,不用丁藥。按理四種藥物各三個水平,應做34=81組實驗,現在只做9組就找出了實驗中并未出現的最佳組合。

  三、預試驗及篩選

  1.預試驗

  在正式實驗前應充分重視預試驗的重要性,小規模的預試驗是使用少量的動物得到預示性的數據或通過預試驗將操作和技術固定并完善,即通過預試驗可了解各因素對實驗的影響,找出最適實驗對象、用藥劑量和實驗條件及檢測指標,如溫度、刺激強度、營養液組方等,為正式實驗做必要的準備,提高實驗的重復穩定性和靈敏度。為此,預試驗中應注意以下問題:

  表4-7  L9(34)正交設計

  (1)實驗穩定性:變異系數越小,說明實驗波動越小,實驗的重復穩定性越好。變異系數CV=。

  (2)實驗靈敏度:預試驗時測定兩個有效量(D1、D2),測定其反應強度(E1、E2)。

  計算因變系數,因變系數越小,實驗靈敏度越好。因變系數CI=(E2-E1)/(lgD2-lgD1)。

  2.篩選

  篩選是在預試驗或既往經驗的基礎上,用少量動物對多種藥物或造模手段進行實驗。一般以P<0.1作為篩選合格的標準,以免漏篩有價值的藥物。常見篩選實驗有以下幾種。

  (1)保護性實驗(以急性毒性實驗為例):篩選解毒藥時,常將各解毒藥與毒劑的半數致死量(LD50)合用,連用4只非純品系動物,如無死亡,表明該藥篩選合格(P<0.1);如有一只動物死亡時,可增加3只動物再試,如3只不死,也為篩選合格。總之,當死亡率為0/4、1/7、2/9、3/12、4/14時均可認為篩選合格。當然,篩選合格表示值得進行正式實驗,不一定正式實驗必定有良好結果。

  (2)概率判別實驗:本法應用范圍更廣,對幾只動物用藥檢測其陽性反應數,就可根據概率論推算出該藥陽性率的大致情況,參見表4-8。

  表4-8  概率判別實驗(P<0.1)

  一、LD50值測定

  1.要求和注意事項

  (1)動物:多用非純品系動物(能反應個體差異),如小鼠,健康雌雄各半,20±2g為宜,日齡達到性成熟。

  (2)實驗條件:在有控制的室溫、光照、飼養和衛生條件下進行。

  (3)藥物及給藥途徑:以靜脈注射、腹腔注射和灌胃為主,最好和臨床上給藥途徑相同。小鼠的用藥量標準為:灌胃給藥應小于1ml;靜脈注射應小于0.2ml;腹腔注射應小于1ml。另外,藥液pH值及滲透壓應在生理范圍內。

  (4)觀察項目和時間:記錄毒性反應的癥狀、原因以及致死時間、致死藥量、致死動物數量等,當發現組織病變時,應取材做病理切片,必要時做組織學檢查,整個實驗觀察7d。

  (5)實驗報告:必須說明實驗條件,制定LD50值為全面表達實驗結果,應求出

  95%可信區間和LD10來表示誤差限度和量效關系,通過LD50和LD10算出LD5、LD95以

  及回歸系數。

  (6)LD50測定法:方法很多,有加權機率單位法(Bliss法)、目測機率單位法、目測圖解法、寇氏法(Korlbor)等,對短期內致死藥物還可采用序貫法。

  (7)對于中毒表現和致死原因的分析應給予充分重視。

  2.LD50值測定步驟

  (1)預試驗:根據經驗或文獻找出實驗動物0和100%死亡的劑量,即上下限劑量(Dn、Dm)。對于無毒性參考資料的藥物,一般先配制最大濃度藥劑,然后倍比稀釋成多個劑量,方法是每組取4只小鼠,按估計劑量梯度依次給藥。如某組死亡數為4/4,其前一組為2/4或3/4則以該組劑量定為Dm,如前一組是0/4或1/4,則以該組劑量的1.5倍定為Dm,同法找出Dn,這樣找出的Dm,Dn比較可靠,為正式實驗提供依據。

  (2)分組:以4~9組為宜,各組給藥劑量按等比關系排列。

  (3)根據實驗結果計算LD50:

  LD50的95%平均可信限LD50±1.4×(LD84一LD16)/

  其中N' 為5%~95%致死率間動物數。

  二、慢性毒性實驗

  1.動物選擇

  至少采用兩種不同種屬的實驗動物,即嚙齒類動物(大鼠、小鼠等)和哺乳類動物(犬、猴等)。一般常采用大鼠和犬兩種,雌雄各半,且動物數量不宜太少,要滿足統計學處理的要求。動物的進化程度越高,對藥物的敏感性越強,慢性毒性實驗的周期較長,所以要盡量選用年齡較小的實驗動物,而且選用未成年的實驗動物在迅速生長時期,可以發現藥物對生長及各組織器官成熟的影響。

  慢性毒性實驗開始選擇的小鼠年齡最好是2~3周,體重8~10g,而大鼠不超過3周,體重50~60g。但是避孕藥物的毒性實驗則要求必須使用性成熟動物,如小鼠應60日齡以上,大鼠應在120日齡以上。

  2.劑量選擇

  常用三個劑量組,大動物可用兩個劑量組,并嚴格按要求設動物對照組。高劑量組(LD50的1/10~1/4劑量)應有輕微可見的毒性反應(或者某些化驗指標有明確而輕微的變化)。中劑量組按LD50的1/30~1/10定量,最低劑量組應是閾劑量組或是無作用劑量組,具體劑量依據實驗目的而定。

  3.給藥途徑

  最好選擇臨床試用的給藥途徑。

  4.給藥期限

  最好是臨床試用的用藥時間(連續給藥)的3~4倍,臨床用藥30d以上者,動物給藥至少半年。

  5.觀察指標

  包括體征、常規血、尿檢查、臟器解剖及肉眼觀察、生化指標檢查等(如新藥則按其國家規定標準核查應有項目)。做病理切片進行組織學檢查(二十幾個臟器),必要時行骨髓檢查、酸堿平衡、水和電解質代謝等。

  由于在慢性毒性實驗中,受試藥物的給藥劑量較低,往往一些觀察指標變化程度較小,因此需注意:在給藥前要觀察并記錄預計的觀察指標,以利于給藥后的比較;在給藥期間進行定期指標觀察時,對照組需同步觀察;實驗結束后,主張將最高劑量組與對照組各留部分動物繼續飼養1~2個月,以便對已出現變化的指標進行追蹤觀察,有助于探討受試藥物對實驗動物有無后續作用,以及損傷可否恢復。

  6.結果定論

  按觀察記錄的結果定論,但不應忽視綜合因素及其他因素對結果的影響。

  三、致癌實驗

  1.動物選擇

  其選擇動物最重要的依據是對誘發腫瘤的易感性,所以應考慮物種、品系、年齡和性別。物種的選擇對受試物有特定的靶器官時尤為重要。同時還應考慮選擇腫瘤自發率低、抗病力強且易管理的實驗動物,一般多選用大、小鼠,雌雄各半,100只以上做一組,動物多為近交系的第一代雜交動物。

  2.劑量選擇

  此點較難,但非常重要,一般使用三個劑量,其中最高劑量應為最大耐受量,理想的最大耐受量不應致死,也不引起可能縮短壽命的毒性表現和病理改變,并且與對照組相比的體重下降不大于10%,中劑量為高劑量的1/4~1/3,低劑量最好相當于或低于人類實際可能接觸的劑量,同時應設計好陰性對照組和陽性對照組。

  3.觀察指標

  體征,一般癥狀,定期稱體重,最主要是密切觀察有無腫瘤發生,如生長有腫瘤,則需要做病理組織切片或電鏡觀察其病理學變化。

  4.結果定論

  一般以組織學結果判定。

  四、其他簡單實驗

  1.局部刺激性實驗

  (1)動物選擇:最好選用與人類皮膚、黏膜反應比較相近的動物,如家兔、豚鼠和小型豬等。動物種屬依據要觀察的指標和模型的合理性進行選擇,通常一個實驗類型選擇一種實驗動物進行評價。刺激性實驗結果從動物外推到人的可靠性有限,如果用兩種動物進行試驗得到類似的結果,則會增加從動物外推到人的可靠性。

  (2)劑量選擇:可選擇幾種不同濃度的制劑進行實驗,其中包括擬用于臨床研究的濃度,為臨床研究的安全性提供選擇依據。可以通過改變給藥頻次進行劑量的調整。對于局部用膏狀制劑,在給藥面積不變的情況下,不應通過增加厚度來滿足增加給藥劑量的目的。

  (3)給藥途徑:一般應與臨床給藥途徑一致,否則應加以說明。

  (4)給藥部位:一般應選擇與臨床應用相似的部位。并注意對可能接觸到受試物的周圍組織的影響。設計劑量和給藥頻次時,應考慮受試動物給藥部位的解剖和生理特點,保證受試物在給藥部位的有效暴露時間。

  (5)觀察指標:首先要進行肉眼觀察,詳細描述動物局部反應,包括紅斑、水腫、充血程度及范圍,并以計分的方式表示,同時觀察動物的一般狀態、行為、體征等;其次進行組織病理學檢查,應詳細描述給藥部位的病理變化,并進行半定量分析、判斷,提供相應的組織病理學照片;最后進行可逆性觀察,若出現刺激性反應,應進行停藥后的恢復期觀察,以明確毒性反應的恢復情況。

  2.過敏性實驗

  通常選用體重300~400g的豚鼠,并需要仔細觀察過敏反應的一系列指標。

  3.異常毒性實驗

  最好選用同一品種小鼠(純品系),體重17~20g,雌性無孕,健康無傷。

  4.熱原檢查

  目前常選用家兔為本實驗動物。在熱原實驗開始之前進行家兔的體溫監測,只有在監測的4h內,家兔的體溫差異不超過0.4℃的即可被用來進行熱原實驗,而且在給約之前的30min內體溫差不超過0.2℃的家兔方可給藥。其給藥途徑為耳緣靜脈注射。在給藥后4h內需要密切監測實驗用家兔的體溫變化。

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