淺談RNA的生物合成

　　核糖核酸（縮寫為RNA，即Ribonucleic Acid），存在于生物細(xì)胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體。下面跟著小編來看看淺談RNA的生物合成吧！希望對你有所幫助。

　　生物界，RNA合成有兩種方式：

　　一是DNA指導(dǎo)的RNA合成，也叫轉(zhuǎn)錄，此為生物體內(nèi)的主要合成方式。

　　另一種是RNA指導(dǎo)的RNA合成(RNA-dependent RNA synthesis)，也叫RNA復(fù)制(RNA replication),由RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase)催化，常見于病毒，是逆轉(zhuǎn)錄病毒以外的RNA病毒在宿主細(xì)胞以病毒的單鏈RNA為模板合成RNA的方式。

　　重點內(nèi)容

　　（一）掌握不對稱轉(zhuǎn)錄、模板鏈和編碼鏈的概念。

　　（二）掌握原核生物RNA聚合酶的全酶及核心酶的組成；熟悉模板與酶的辨認(rèn)結(jié)合，啟動子的概念。了解-35區(qū)、-10區(qū)、上游、下游序列等概念，以及兩區(qū)的作用特點。

　　（三）熟悉原核生物的轉(zhuǎn)錄起始，轉(zhuǎn)錄的方向，原核生物的轉(zhuǎn)錄終止分兩種方式。了解原核生物RNA合成的過程。

　　（四）熟悉真核生物的RNA聚合酶的分類，作用特點以及各自相應(yīng)的產(chǎn)物；了解真核生物轉(zhuǎn)錄過程。

　　（五）掌握斷裂基因、內(nèi)含子、外顯子的概念；

　　（六）熟悉真核生物mRNA,tRNA的修飾過程。

　　復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的相同點：

　　①都是酶促的核苷酸聚合過程

　　②以DNA為模板

　　③遵循堿基配對原則

　　④都需依賴DNA的聚合酶

　　⑤聚合過程都是生成磷酸二酯鍵

　　⑥新鏈合成方向為5’→3’

　　原核生物轉(zhuǎn)錄的模板和酶

　　Section1Templates and Enzymesin Prokaryotic Transcription

　　原核生物轉(zhuǎn)錄的模板

　　DNA分子上轉(zhuǎn)錄出RNA的區(qū)段，稱為結(jié)構(gòu)基因(structuralgene)。

　　轉(zhuǎn)錄的這種選擇性稱為不對稱轉(zhuǎn)錄(asymmetric transcription)，它有兩方面含義：

　　在DNA分子雙鏈上，一股鏈用作模板指引轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄；

　　模板鏈并非總是在同一單鏈上。

　　全稱：依賴DNA的RNA聚合酶（DDRP）。

　　RNA合成的化學(xué)機制與DNA聚合酶催化DNA合成相似，沿5‘→3’聚合RNA。

　　兩種酶的異同

　　引物酶催化轉(zhuǎn)錄的RNA-pol

　　共同點:本質(zhì)上都是一種依賴DNA的RNA聚合酶（DDRP）;

　　催化游離的NTP聚合。

　　區(qū)別:①復(fù)制起始時聚合短鏈RNA作

　　為引物，以提供3ˉ-OH末端，

　　使子代DNA鏈能夠延長。

　　②dnaG基因編碼，

　　③對利福平不敏感轉(zhuǎn)錄時催化子鏈延長對利福平敏感

　　DNA聚合酶在啟動DNA鏈延長時需要引物存在，而RNA聚合酶不需要引物就能直接啟動RNA鏈的延長。

　　RNA聚合酶和DNA的特殊序列——啟動子(promoter)結(jié)合后，就能啟動RNA合成。原核生物中的RNA聚合酶全酶由五個亞基構(gòu)成，即**（ω），分子量達(dá)480kD。

　　亞基能引導(dǎo)RNA-pol穩(wěn)定的結(jié)合在DNA啟動子上。

　　亞基存在對核心酶的構(gòu)象有較大影響，能導(dǎo)致RNA-pol與DNA上的一般序列和啟動子序列的親和力有很大不同：

　　極大降低了酶與DNA一般序列的結(jié)合常數(shù)，和停留時間，同時又增加了酶與啟動子的親合力和停留時間

　　其他原核生物的RNA聚合酶，在結(jié)構(gòu)、組成、功能上均與E.coli相似。

　　抗結(jié)核藥利福平或利福霉素可專一性地結(jié)合RNA聚合酶的β亞基，抑制RNA合成。原核生物一個轉(zhuǎn)錄區(qū)段可視為一個轉(zhuǎn)錄單位，稱為操縱子(operon)，包括若干個結(jié)構(gòu)基因及其上游(upstream)的調(diào)控序列。

　　啟動子(啟動序列，promoter)是RNA聚合酶結(jié)合并起動轉(zhuǎn)錄的特異DNA序列。啟動子(promoter)是調(diào)控序列的一部分,控制轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵部位，決定著基因的表達(dá)強度。

　　原核生物RNA轉(zhuǎn)錄合成的過程

　　一、轉(zhuǎn)錄起始需要RNA聚合酶全酶

　　RNA聚合酶必須準(zhǔn)確地結(jié)合在轉(zhuǎn)錄模板的起始區(qū)域。

　　DNA雙鏈解開，使其中的一條鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板。

　　轉(zhuǎn)錄起始過程：

　　1.RNA聚合酶全酶與模板結(jié)合，形成閉合轉(zhuǎn)錄復(fù)合體(closed transcription complex)；

　　2.DNA雙鏈局部解開，形成開放轉(zhuǎn)錄復(fù)合體(open transcription complex)；

　　3.第一個NTP加入，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物：

　　DNA雙鏈解開的范圍只有≈17bp，比復(fù)制叉小得多。

　　轉(zhuǎn)錄起始生成RNA的5’總是GTP，且保留三個磷酸基團(tuán)

　　第一個磷酸二酯鍵生成后，σ亞基即從轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物上脫落，核心酶連同四磷酸二核苷酸，繼續(xù)結(jié)合于DNA模板上，酶沿DNA鏈前移，進(jìn)入延長階段。

　　二、原核生物的轉(zhuǎn)錄延長時蛋白質(zhì)的翻譯也同時進(jìn)行

　　亞基脫落，RNA–pol聚合酶核心酶變構(gòu)，與模板結(jié)合松弛，沿著DNA模板前移；在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長。

　　三、原核生物轉(zhuǎn)錄終止分為依賴ρ(Rho)因子與非依賴ρ因子兩大類

　　轉(zhuǎn)錄終止指RNA聚合酶在DNA模板上停頓下來不再前進(jìn)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上脫落下來。

　　依賴Rho(ρ)因子的轉(zhuǎn)錄終止

　　非依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止

　　（一）依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止

　　ρ因子是由相同亞基組成的六聚體蛋白質(zhì)，亞基分子量46kD。

　　ρ因子能結(jié)合RNA，又以對polyC的結(jié)合力最強。

　　ρ因子還有ATP酶活性和解螺旋酶(helicase)的活性。

　　目前認(rèn)為，ρ因子終止轉(zhuǎn)錄的作用是：與RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)合，結(jié)合后ρ因子和RNA聚合酶都可發(fā)生構(gòu)象變化，從而使RNA聚合酶停頓，解螺旋酶的活性使DNA/RNA雜化雙鏈拆離，利于產(chǎn)物從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中釋放。

　　（二）非依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止

　　DNA模板上靠近終止處，有些特殊的堿基序列，轉(zhuǎn)錄出RNA后，RNA產(chǎn)物形成特殊的結(jié)構(gòu)來終止轉(zhuǎn)錄。

　　終止點處存在相連的富含GC的回文結(jié)構(gòu)，使RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成發(fā)夾形的二級結(jié)構(gòu)，其后又有一段寡聚U

　　真核生物的轉(zhuǎn)錄過程

　　真核生物的轉(zhuǎn)錄過程比原核復(fù)雜。二者的轉(zhuǎn)錄起始過程有較大區(qū)別，轉(zhuǎn)錄終止也不相同。

　　一、真核生物有三種DNA依賴性RNA聚合酶

　　真核生物具有3種不同的RNA聚合酶:

　　RNA聚合酶Ⅰ（RNAPolⅠ）RNA聚合酶Ⅱ（RNAPolⅡ）RNA聚合酶Ⅲ（RNAPolⅢ）三種RNA聚合酶均由10～12個大小不同的亞基組成，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，功能上存在差異。

　　真核生物RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的結(jié)構(gòu)比原核生物復(fù)雜，都由多個亞基組成。有些亞基是三種酶所共有。

　　所有真核生物的RNA聚合酶都有兩個不同的大亞基和十幾個小亞基.

　　mRNA是各種RNA中壽命最短、最不穩(wěn)定的，需經(jīng)常重新合成。因此RNA聚合酶Ⅱ是三種酶中最活躍的。

　　RNA聚合酶Ⅱ由12個亞基組成，其最大的亞基稱為RBP1。

　　【拓展知識】

　　真核細(xì)胞rna提取的實驗報告范文

　　一．原理

　　本方法利用鹽酸胍抑制RNA酶，勻漿裂解細(xì)胞，采用有機溶劑抽提去除蛋白質(zhì)。通過選擇性沉淀RNA分子去除DNA。

　　二．方法

　　1.樣品處理

　　⑴組織樣品處理：取新鮮的組織樣品稱重后，剪碎成約1cm2的組織塊直接加入勻漿液中進(jìn)行RNA提取，或液氮中速凍-70℃保存。

　　⑵貼壁培養(yǎng)細(xì)胞處理：用PBS洗細(xì)胞一次，吸干溶液后將培養(yǎng)板快速移至液氮中冷凍后轉(zhuǎn)到-70℃保存；或加入1ml勻漿至培養(yǎng)板中直接裂解細(xì)胞，然后將粘稠的裂解液進(jìn)一步勻漿。

　　⑶懸浮培養(yǎng)細(xì)胞處理：離心收集細(xì)胞，用PHS懸浮漂洗再田心收集，若不立即提取RNA，則可經(jīng)液氮速凍后轉(zhuǎn)至一70℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

　　2．加l()倍體積鹽酸胍勻漿液[至準(zhǔn)備好的樣品細(xì)胞中，高速勻漿1min。

　　3．勻漿液5000g，室溫離心10min。

　　4．將上清移至一個干凈離心管中，加入0.1體積的3mol／L乙酸鈉（PH5.2），混勻，再加5體積預(yù)冷的乙醇，立即充分混勻，-20℃放置至少2小時。

　　5．5000g 0℃離心10分鐘沉淀核酸，棄上清液，室溫干燥。

　　6，每個提取RNA的組織或細(xì)胞樣品中，加入l0～15min鹽酸胍勻漿液Ⅱ，攪拌溶解。

　　7．加入2.5體積預(yù)冷的乙醇，立即充分混勻，-20℃至少放置2小時。

　　8．5000g 0℃離心10分鐘沉淀核酸，去上清，室溫?fù)]發(fā)乙醇。

　　9．按每克組織細(xì)胞加5min的比例．分兩次加入0.02mol／L EDTA(pH8.0) 先加1／2體積EDTA振蕩l～2分鐘，3000g離心2min．吸出上清．再加另一個1/2體積的EDTA振蕩l一2分鐘．合并兩次核酸溶解液。．

　　10．用等體積氯仿—正丁醇(4：1)抽提核酸溶液，5000g室溫離心l0min，5000g室溫離心10min。吸出上清至另一個干凈離心管中。

　　11．加3倍體積lmol／L乙酸鈉 (PH7.0) 混勻，-20℃放置1h以上，此時RNA將選擇地沉淀，而DNA仍為溶解狀況。

　　12．5000g，0℃離心20min，沉于管底的是RNA。

　　13．吸去上清，用4℃預(yù)冷的lmol／L乙酸鈉(pH7．0)漂洗RNA沉淀。然后20℃ 5000g，離心20分鐘。回收RNA。

　　14．盡量去除上清液。按每g組織細(xì)胞1m的比例加入RNA溶解液(0.2％SDS，0.5％mol／L EDTA，pH8.0)。注意：若有SDS沉淀析出．滴加0.11mol／L NaOH調(diào)溶液pH至7．5。

　　15．加入2倍體積冰預(yù)冷乙醇混勻，0℃放置至少2小時，5000g，4℃離心10分鐘，RNA沉淀用70％乙醇漂洗，短暫離心后，棄上清，室溫干燥蒸發(fā)乙醇。

　　16．用適當(dāng)小容積DEPC處理過的ddH2O溶解RNA沉淀，加入3倍體積乙醇，

　　-70℃保存RNA備用。用時．加入0.1體積的3mol／L乙酸鈉，混勻，12000g，4℃離心回收RNA。

　　三.試劑

　　1．鹽酸胍勻漿液Ⅰ

　　成分：8mol／L鹽酸胍(分子量為95.6)，O．1mol／L乙酸鈉(pH5．2)，5mmol／L 2—巰基乙醇，0.5％十二烷基肌氨酸鈉

　　配制方法：取191g鹽酸胍．加8.35m1 3mol／L乙酸鈉(pH5．2)和6．25ml 0．2mol／L 2—琉基乙醇溶液中，再加水至237．5ml，混勻后加12．5ml 10％十二烷基肌氨酸鈉,振蕩混勻溶解。

　　2．鹽酸胍勻漿液Ⅱ

　　成分：8mol／L鹽酸胍(分子量力95.6),0.1mol／L乙酸鈉(pH5．2),1mmol／L 2

　　—琉基乙醇，20mmol／L EDTA(pH8.0)

　　配制方法：取191g鹽酸胍，加日．35ml 3mol／I。乙酸鈉(pH5．2)和1．25ml 0．2mol

　　／L 2—巰基乙醇溶液中，再加入10ml 0.5mol／L EDTA(pH8.0)。加水至250ml混勻。

　　3.乙醇

　　4.70％乙醇

　　5.氯仿—正丁醇(4：l，體積比)

　　6.4mol／L乙醇鈉，pH7.0

　　7.3mol／L乙醇鈉，pH5.2

　　8.RNA溶解液

　　成分：O．2％SDS．0.05mol／L EDTA, pH8.0

　　四、說明

　　提取RNA時，要特別注意防止RNase的污染，所用玻璃器皿均應(yīng)用0.1％的二乙基焦碳酸鹽(diethyl pyrocarbonate，DEPC)處理。塑料器材均使用一次性用品，并高壓滅菌處理，必要時，也可用0.1%DEPC處理。