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會影響藥品微生物檢驗結果的因素

時間:2022-12-05 15:33:17 松濤 生物/化工/環保/能源 我要投稿
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會影響藥品微生物檢驗結果的因素

  在現實學習生活中,是不是經常追著老師要知識點?知識點也可以通俗的理解為重要的內容。那么,都有哪些知識點呢?以下是小編收集整理的會影響藥品微生物檢驗結果的因素,供大家參考借鑒,希望可以幫助到有需要的朋友。

會影響藥品微生物檢驗結果的因素

  微生物的生長受很多因素的影響,特別是藥品中污染的微生物尤為如此。藥品微生物檢驗是檢測藥品中具有繁殖能力的活細胞,這些活的微生物在藥品中處于不穩定的狀態,它的檢出與否受很多因素的影響,主要影響因素有如下幾點:

  一、供試品組分

  由于供試品本身的特性,可能含有具有抑菌作用的組分成分,如抗生素中藥中的黃蓮、牛黃、冰片等。另外,很多供試品中加入的抑菌劑或防腐劑用于防止供試品中的微生物再污染和再生殖,以及增溶劑、乳化劑、抗氧劑等其他輔料,這些組分在一定濃度下對微生物具有抑制作用,并可能對藥品中污染的微生物造成不同程度的損傷。供試品中污染的微生物在這些物質的影響下有可能檢不出,這時,它們雖然被抑制甚至受到損傷,但并未死亡,在一定條件在塔門還可以穩定地存活一段時間,當微生物生存環境改變時,如抑菌成分消除或濃度降低時,這些微生物便可以復蘇并繁殖,患者使用后同樣可危及人體健康。對于這些藥品,如按常規方法進行微生物檢驗,往往顯示假陰性結果。

  除此之外,在藥品微生物檢驗中,由于原料來源不同,特別是中藥制劑,或者生產工藝的差別,使用的輔料不同等原因,使不同廠家生產的同一產品,甚至是同一廠家生產的同一產品不同批次的藥品往往對同一中微生物的生長也有不同程度的影響。

  從理論上講,許多藥品含有影響微生物生長的物質,許多試驗也表明了這一點,表12-1列出了已知試驗菌的菌數在不同藥品中的回收率,有的藥品幾乎對所有試驗菌均有很強的抑制或殺死作用。因此,供試品的組分及其濃度直接影響供試品中污染微生物的檢查結果準確與否。

  二、藥品微生物的檢查方法

  檢查方法包括供試液制備方法和微生物檢測方法,它是保證檢驗結果準確可靠的最重要前提。

  微生物檢測時,首先進行供試液的制備,不同特性的供試品,應采用不同的供試液制備方法,如水溶性供試品直接加稀釋劑制備即可;不溶水的固體供試品采用勻漿或加混懸劑制成均勻的混懸液;非水溶性油劑或軟膏劑,因其與水難溶,使其中污染的微生物難與培養基接觸或因缺氧而無法生長,需采用乳化劑使成均勻分散的乳濁液;有抑菌成分的供試品客加入消除抑菌成分的中和劑;離心沉淀及薄膜過濾消除抑菌成分的方法等,這些物理或化學的供試液制備方法在進行過程或多或少影響著供試品中微生物的回收。

  同一份供試液采用不同的微生物檢測方法,如常規法、培養基稀釋法、薄膜過濾法、MPN法等,其檢測的結果可不同,因為其中所含的供試品濃度不同,特別是有抑菌作用的供試品。

  藥品微生物控制的發展的研究

  微生物污染是藥品質量評估的重要指標,目前各國藥典收錄的藥品無菌檢查和微生物限度檢查方法只對藥品終產品質量進行評價,且對無菌檢查不合格的藥品要求不得進行復驗。藥品微生物檢測實驗室如缺少對實驗環境的監督和控制,則無法評估微生物陽性結果的污染來源。而藥品檢測過程中的微生物陽性結果可能源于實驗過程中環境的污染,因此判斷檢出菌與環境菌的相關性,是排除實驗過程污染、減少假陽性結果、提高檢驗結果準確性的必不可少的環節。同時現階段藥品安全管理仍存在監管漏洞,當藥品受到致病微生物污染時,往往出現定溯源難、應變慢等問題。若建立微生物檢測實驗室日常的環境微生物菌庫,則可較好地解決上述問題。目前國外通過分子生物學手段對病原微生物建庫的研究較多,如RIDOMwebsite提供根據16SDNA序列的差異建立的病原微生物庫。國內對制藥環境建立環境微生物菌庫相關方面的研究也有報道,如PEI等曾采用FTIR法構建潔凈室環境菌的FTIR譜庫,但該方法對微生物的培養條件及預處理要求嚴格,隨機誤差也較大。目前在藥品微生物檢測實驗室建立環境微生物菌庫方面的研究仍較少。

  本研究從筆者工作的藥品微生物檢測實驗室環境中不同部位、設備材料及活動人員進行連續7個月采樣收集微生物,共獲得248株細菌和6株霉菌,對收集的細菌采用全自動微生物生化鑒定儀(Vitek2Compact)進行鑒定,對生化鑒定無確切結果的90株細菌及6株霉菌均采用3500MicroSeq基因測序分析系統進行細菌16SrDNA和霉菌LSUrDNA測序鑒定,并對某次采樣收集獲得的6株金黃色葡萄球菌米用Diversilab進行同源性分析。通過對鑒定結果的整理和分析,初步建立了藥品微生物檢測實驗室環境微生物庫,為今后本實驗室微生物檢測結果污染溯源調查提供了信息保障,同時也為制藥企業開展建立環境微生物信息庫和微生物污染溯源提供了技術指導。

  1材料與方法

  1.1儀器與試劑

  光學顯微鏡(日本奧林巴斯);VITEK2Compact全自動微生物生化儀、全自動革蘭氏染色儀、Diversilab同源性分析系統(法國梅里埃);梯度96孔VertiPCR儀(美國ABI公司);PowerpacBasic電泳儀(美國Bio-Rad公司);3500MicroSeq全自動微生物基因分析鑒定系統(美國ABI公司)。

  1.2環境微生物的收集

  連續7個月對微生物實驗室環境中不同部位、活動人員及設備材料采用胰蛋白胨大豆瓊脂(廣東環凱)平板,分別通過接觸碟法(人員身上取樣)、浮游菌采樣器(環境浮游微生物取樣)、空氣沉降法(環境沉降微生物取樣)及棉簽擦拭法(設備和材料表面取樣)進行微生物樣本采集,分離純化后共獲得248株細菌和6株霉菌,采用甘油凍存管置-70°C冰箱保存。

  1.3生化鑒定

  采用VITEK2Compact對獲得的248株細菌的新鮮培養物根據革蘭染色鏡檢結果選取GN、GP、BCL不同鑒定試劑卡進行生化鑒定。

  1.4細菌16SrDNA及霉菌LSUrDNA測序鑒定對VITEK鑒定無確切鑒定結果的90株細菌及6株霉菌分別采用3500MicroSeq全自動微生物基因分析鑒定系統進行細菌16SrDNA和霉菌LSUrDNA測序鑒定。采用3500MicroSeq系統配套試劑對90株細菌和6株霉菌的TSA平板培養物分別進行DNA抽提、PCR擴増和純化、標記反應及標記反應純化,最后進行毛細管電泳測序。

  1.56株金黃色葡萄球菌的Diversilab同源性分析某次采樣收集到6株菌,采用VITEK生化鑒定和16SrDNA測序鑒定結果均為金黃色葡萄球菌,且在所測16SrDNA基因片段中序列完全相同。為進一步獲得6株菌的分型信息,采用基于重復序列擴増技術的Diversilab同源性分析系統進行實驗。對6株菌分別米用DiversiLab儀器配套的金黃色葡萄球菌的rep-PCR擴増試劑盒先進行擴増,后吸取1^LPCR產物加入芯片的標本孔,進行電泳分離擴増的DNA的片段,采用儀器自帶軟件繪制基因分型同源性關系圖。

  2結果

  2.1菌株來源統計

  本次建庫收集到環境微生物分離菌株共計254株,包括248株細菌和6株霉菌,所有的霉菌均來源于沉降菌收集。大部分菌株均來源于在微生物實驗室活動的人員(137株),占全部分離菌株的53.9%。其余環境沉降微生物(30株)、環境浮游微生物(47株)及來源于設備和材料表面的微生物(40株)占全部分離菌株比例相差不大,分別為11.8%,18.5%和15.7%。

  2.2環境微生物菌庫的建立

  結合生化鑒定和測序鑒定結果的254株微生物的鑒定結果統計。其中葡萄球菌屬細菌最多,占全部分離菌的34.3%;其次為芽孢桿菌和微球菌,分別占全部分離菌的32.7%和12.6%。環境沉降菌和空氣浮游菌共收集到77株微生物,占污染微生物總數的30.3%。

  葡萄球菌和藤黃微球菌均為常見環境菌。從設備材料和操作人員共收集分離表面微生物177株,占污染微生物總數的69.7%。污染微生物比例最高的分別為芽孢桿菌屬、菌,分別占表面微生物總數的29.9%、15.8%和14.1%。采用生化鑒定和測序鑒定2種方法對微生物實驗室環境中收集到的254株菌進行鑒定,通過鑒定結果的整理和分析,初步建立了藥品微生物檢測實驗室環境微生物庫。

  2.3 6株金黃色葡萄球菌的同源性分析結果

  6株金黃色葡萄球菌米用Diversilab系統進行同源性分析,實驗結果顯示6株金黃色葡萄球菌高度同源,最低菌株間的親緣關系也達到99%(親緣關系>95%,即為同源),所以6株菌應該來自同一個污染源。

  3討論

  從建立的環境微生物庫各方面的對比情況分析可知,大部分微生物均來源于微生物實驗室中活動的人員。葡萄球菌屬和微球菌屬細菌為人體易攜帶污染的微生物,這兩類微生物在多個采樣點均有發現,所以可能是由于人員活動或表面接觸帶來的交叉污染,表明操作人員攜帶的微生物是實驗室環境菌的主要來源之一,為了減少污染應嚴格控制人員的更衣和清潔程序。環境中同樣存在著多種芽孢桿菌,在環境中不易被消毒滅菌,可能是由于消毒頻次和消毒劑效力問題導致的殘留污染,應該増加消毒滅菌頻率并有計劃地更換消毒劑確保杜絕污染。

  本研究通過7個月的持續采樣收集環境微生物,初步建立了藥品微生物檢測實驗室的環境微生物庫,但是環境微生物庫的建立是個持續動態的過程,因此需要在日常監測中不斷完善。本次建庫采用微生物鑒定(生化鑒定和測序鑒定)和分型技術(Diversilab同源性分析系統)對微生物實驗室進行監控,建立和健全了日常監督檢查方法,為今后開展污染水平的風險評估和不良事件調查提供技術平臺,同時也為高風險藥品生產企業建立環境微生物數據庫提供技術指導。

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