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分子實驗[優(yōu)秀]

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分子實驗[優(yōu)秀范文]

  學(xué)院:專業(yè)班級:課程:實驗名稱:組員:實驗日期:

  一、實驗?zāi)康?/strong>

  1、學(xué)習(xí)與掌握利用ITS序列鑒定真菌的原理;

  2、掌握用ITS序列鑒定真菌的方法有步驟。

  二、實驗原理

  1、菌物是真核生物的重要類別,傳統(tǒng)的菌物分類以子實體形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)為分類基礎(chǔ),由于部分菌物的子實體不易獲得,形態(tài)特征不易掌握,少數(shù)形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)隨著環(huán)境的變化而不穩(wěn)定,是傳統(tǒng)的菌物鑒定工作困難或分類系統(tǒng)意見分歧。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS(internal transcribed space),位于5.8S和18S之間(ITS1)以及5.8S和28SrDNA之間(ITS2),ITS1和ITS2常被合稱為ITS,并且5.8SRNA基因也被包括在ITS之內(nèi)。近年來,利用真核生物在rDNA的ITS區(qū)域既具保守性又在科、屬、種水平上均有特異性序列的特性,對ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴增、測序。隨著核糖體rDNA ITS序列分析技術(shù)在菌物研究中的應(yīng)用,一些分類地位不明確、親緣關(guān)系不清楚的物種通過該技術(shù)得到了解決,一些重要的菌物遺傳信息得到闡明。

  2、ITS(Internal Transcribed Spacer):內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)。是真菌核糖體RNA(rRNA)基因非轉(zhuǎn)錄區(qū)的一部分。用于真菌鑒定的ITS序列通常包括ITS1、5.8 S和ITS2。真菌ITS區(qū)域長度一般在650~750 bp(堿基對)。

  ITS(Internal Transcribed Spacer)鑒定是指對ITS序列進(jìn)行DNA測序,通過將測序得到的ITS序列與已知真菌ITS序列比較,從而獲得未知真菌種屬信息的一種方法。

  ITS鑒定的原理:rDNA上的5.8、18和28 SrRNA基因有極大的保守性,即存在著廣泛的異種同源性。而由于ITS區(qū)不加入成熟核糖體,所以ITS片段在進(jìn)化過程中承受的自然選擇壓力非常小,因此能容忍更多的變異。在絕大多數(shù)的真核生物中表現(xiàn)出了極為廣泛的序列多態(tài)性,即使是親緣關(guān)系非常接近的2個種都能在ITS序列上表現(xiàn)出差異,顯示最近的進(jìn)化特征。研究表明,ITS片段的進(jìn)化速率是18 S rDNA的10倍。這就是ITS序列在微生物種類鑒定和群落分析的理論基礎(chǔ)。ITS1和ITS2是中度保守區(qū)域,其保守性基本上表現(xiàn)為種內(nèi)相對一致,種間差異比較明顯。這種特點使ITS適合于真菌物種的分子鑒定以及屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。由于ITS的序列分析能實質(zhì)性地反映出屬間、種間以及菌株間的堿基對差異,此外ITS序列片段較小、易于分析,目前已被廣泛應(yīng)用于真菌屬內(nèi)不同種間或近似屬間的系統(tǒng)發(fā)育研究中。ITS的序列分析還有效地解決Lenti nul a、Suill us、Tuber、Cer at ocystis和Oi diodendron等真菌應(yīng)用形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行分類所引起的紛爭,彌補了傳統(tǒng)分類上的一些不足。

  ITS 鑒定的方法學(xué):真菌rDNA ITS序列分析用于真菌系統(tǒng)分類通常通過多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)實現(xiàn)。rDNA多復(fù)制的特性,有利于低濃度或被更高度降解的DNA樣品中ITS區(qū)域的擴增。這有利于研究尚無任何rDNA序列資料的生物。根據(jù)這些基因上高度保守區(qū)段設(shè)計出通用引物,借助PCR技術(shù)擴增rDNA的目的片段。PCR技術(shù)在真菌分類、鑒定中與直接測序法相結(jié)合有很大的優(yōu)越性[ 14] : ①只需少量的DNA,每次擴增只需約0.1~10 ng;②可對DNA的2條鏈測序,從而減少錯誤;③可利用總DNA的較粗制備品;④適合于自動測序儀進(jìn)行測序。

  三、實驗器材

  1、真菌總基因組DNA的提取及其純度、濃度的檢測:

  1)、儀器:離心機離心管移液槍(200μL、1000μL)槍頭研缽恒溫水浴鍋超凈工作臺瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)一次性手套凝膠成像系統(tǒng)

  紫外分光光度計

  2)、材料:真菌3)、試劑:

  (1)、DNA提取液:0.2M Tris-HCl(pH 7.5),0.5M NaCl,0.01M EDTA,1%SDS

  (2)、3M NaAc

  (3)、TE:10 mmol/L Tris-HCl pH8.0,1 mmol/L EDTA

  (4)、酚(pH8.0):氯仿:異戊醇(25:24:1)

  (5)、氯仿:異戊醇(24:1)(6)、異丙醇

  (7)、無水乙醇

  (8)、75%乙醇

  (9)、加入巰基乙醇(10)、RNaseA

  2、ITS片段的PCR擴增及其產(chǎn)物電泳檢測:

  1)、儀器:PCR熱循環(huán)儀瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)移液槍一次性手套2)、材料:真菌ITS片段3)、試劑:

  (1)、引物:ITS4:5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’(5’端引物)ITS5: 5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’(3’端引物)

  (2)、ddH2O(2.5mM)

  (3)、10×MgCl2緩沖液

  (4)、DNA模板

  (5)、脫氧核糖核酸聚合酶(Taq酶)

  (6)、50×TAE貯存液

  (7)、6×加樣緩沖液

  (8)、100bpDNA ladder。

  (9)、溴酚藍(lán)染料

  3、ITS片段測序

  1)、儀器:PCR熱循環(huán)儀高壓電泳儀測序用電泳槽制膠設(shè)備吸頭、與電泳玻璃相配的染色盤、小指管

  2)、材料:ITS片段PCR擴增產(chǎn)物3)、試劑:

  藥品:三羥甲基氨基甲烷(Tris)乙二胺四乙酸(EDTA)硼酸尿素丙烯酰胺N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)過硫酸銨冰乙酸碳酸鈉(Na2CO3)甲醛硫代硫酸鈉硝酸銀(AgNO3)測序級Taq DNA聚合酶4種d/ddNTP混合液pGEM-3ZF(+)對照DNA 1μg/μL ITS4/ITS5正向引物粘合硅烷硅烷

  溶液:

  (1)、5×TBE:

  Tris 13.5g硼酸6.9g EDTA 0.9g用雙蒸水定容至250mL

  (2)、6%變性聚丙烯酰胺凝膠貯液:

  尿素

  63.06g

  丙烯酰胺8.5g

  N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺0.45g 5×TBE 15mL用雙蒸水定容至150mL(用普通濾紙過濾后使用)。

  4、BLAST比對、鑒定屬、種:

  儀器:電腦及攜帶BLAST程序(基本局部相似性比對搜索工具)

  5、進(jìn)化樹的繪制

  儀器:電腦及攜帶MEGA軟件(分子進(jìn)化遺傳分析)

  四、實驗內(nèi)容及步驟

  (一)、實驗內(nèi)容:

  1、大量真菌的準(zhǔn)備;

  2、真菌總基因組DNA的提取;

  3、真菌基因組DNA純度、濃度的檢測;

  4、ITS片段的PCR擴增;

  5、ITS片段的PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測;

  6、ITS片段測序;

  7、BLAST比對、鑒定屬、種。

  (二)、實驗步驟:

  1、真菌總基因組DNA的提取及其純度、濃度的檢測:

  (1)、準(zhǔn)備大量的真菌,然后去1g真菌,在液氮中迅速研磨成粉。

  (2)、2%CTAB抽提緩沖液在65℃水浴中預(yù)熱;

  (3)、在1.5mL離心管中加入65℃預(yù)熱的抽提液700μL。

  (4)、加入巰基乙醇50μL,上下震蕩,使蛋白質(zhì)變性沉淀,65℃水浴40min,每隔10min振蕩混勻一次。

  (5)、加入等體積(約750μL)的氯仿/異戊醇(24/1)混勻,除去蛋白質(zhì),4℃平衡離心,10000rpm,10min。(6)、取上清(約750μL)到1.5mL離心管中,加1/5體積(約150μL)65℃預(yù)熱的CTAB/NaCl混勻,加入600μL的氯仿/異戊醇(24/1)混勻,4℃平衡離心,10000rpm,10min。

  (7)、取上清,加等體積(約750μL)的CTAB沉淀液,顛倒混勻。65℃水浴30min至沉淀可見。4℃平衡離心,10000 rpm,10min后小心去上清。

  (8)、沉淀用TE(0.5mL)溶解,加入等體積(約0.5mL)的酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)抽提,4℃平衡離心,10000rpm,10min。

  (9)、取上清加入2倍體積的無水乙醇(1mL),再加入1/10體積的NaAC(pH 5.2)約0.1mL。

  (10)、-20℃冰箱1h,4℃平衡離心,12000rpm,10min,棄上清,用70%酒精清洗2次,濾紙吸去多余水分,超凈臺吹干。

  (11)、0.05mL TE溶解,加入5μLRNA酶液37℃放置30min;(12)、吸取適量樣品于紫外分光光度計上檢測濃度與純度;

  (13)、剩余的樣品置于-20℃保存待用。

  2、ITS片段的PCR擴增及其產(chǎn)物電泳檢測

  ITS4:5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’ ITS5: 5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’

  1)、PCR Amplification reaction system(PCR擴增反應(yīng)體系)(50μl)ddH2O 38.5μl 10×buffer with MgCl2(MgCl2緩沖液)5.0μl dNTPs(2.5mM)1.0μl Primer5’(5’端引物)2.0μl Primer3’(3’端引物)2.0μl DNA template(DNA模板)1.0μl Taq DNA polymerase(脫氧核糖核酸聚合酶)(5U/μl)0.5μl

  2)、反應(yīng)程序如下:

  (1)94℃ for 5 minutes denaturalization(94℃預(yù)變性5min)

  (2)94℃ for 45 seconds denaturation(94℃變性45s)

  (3)52℃ for 45 seconds annealing(52℃退火45s)

  (4)72℃ for 1min30sec extension(72℃延伸90s)重復(fù)步驟(2)-(4)30次

  (5)72℃ for 10 minutes final extension(72℃最后一次延伸10min)大概500bp左右

  3)、取5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測,其余-20℃保存:

  (1)、瓊脂糖凝膠:將50×TAE貯存液用蒸餾水稀釋成1×TEA電泳緩沖液,待用,按1%稱取適量瓊脂糖置于250mL錐形瓶中,加入對應(yīng)量1×TEA稀釋緩沖液,蓋上封口膜,以減少水分蒸發(fā),放入微波爐里加熱沸騰,取出搖勻,使瓶壁上粘附的瓊脂糖全部溶解,反復(fù)3次,至瓊脂糖全部溶化,放置,待其稍冷卻。

  (2)、膠板的制備:將制膠槽置于水平支持物上,選擇合適厚度和齒數(shù)的樣品梳,插上梳子。向冷卻至50-60℃的瓊脂糖凝膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液數(shù)滴,搖勻,小心地倒入制膠槽內(nèi),使膠液形成均勻的膠層。待膠完全凝固后,小心拔出梳子,將膠塊取出,至于已加入足量1×TEA電泳緩沖液的電泳槽內(nèi)。

  (4)、加樣:取5μl樣品與2μl 6×加樣緩沖液混勻,用微量移液槍小心加樣品槽中,在第一個孔或最后一個上樣孔內(nèi)加入5μl的100bpDNA ladder。

  (5)、電泳:接通電泳槽與電泳儀的電源,以5V/cm(約100V)電泳,當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動到距凝膠前沿1-2cm處,停止電泳。

  (6)、成像:戴上一次性手套,在波長為254nm的紫外燈下觀察膠塊,DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶,用凝膠成像系統(tǒng)照相。

  3、ITS片段測序

  (一)測序反應(yīng):

  1.對于每組測序反應(yīng),標(biāo)記四個0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml適當(dāng)?shù)膁/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(約20ml)石蠟油,蓋上蓋子保存于冰上或4℃?zhèn)溆谩?/p>

  2.對于每組四個測序反應(yīng),在一個eppendorf管中混合以下試劑:

  (1)樣品反應(yīng):

  質(zhì)粒模板DNA 2.1pmol 5×測序緩沖液5ml引物4.5pmol無菌ddH2O至終體積16ml

  (2)對照反應(yīng)

  pGEM-3Zf(+)對照DNA(4mg)4.0ml

  5×測序緩沖液5ml

  ITS4/ITS5正向引物(4.5pmol)3.6ml

  無菌ddH2 O至終體積16 ml

  3.在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml測序級Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸動幾次混勻。

  4.從第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一個d/ddNTP混合物的管內(nèi)。

  5.在微量離心機中離心一下,使所有的溶液位于eppendorf管底部。

  6.把G、A、T、C 4個反應(yīng)管放入預(yù)熱至95℃的熱循環(huán)儀,先經(jīng)過95℃ 2min,然后進(jìn)入如下循環(huán):

  95℃ 30s變性42℃ 30s退火70℃ 1min延伸45-60個循環(huán)后,取出置于冰箱中

  7.熱循環(huán)程序完成后,在每個小管內(nèi)加入3μl DNA測序終止溶液,在微量離心機中略一旋轉(zhuǎn),終止反應(yīng)。

  (二)、測序凝膠板的制備

  1、玻璃板的處理:

  (1)短玻璃板的處理

  A.在1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷(Bind Silane),配成新鮮的粘合溶液。

  B.用經(jīng)浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉紙擦拭仔細(xì)清洗過并已經(jīng)自然干燥的玻璃板,整個板面都必須擦拭。

  C.4-5分鐘后,用95%乙醇單向擦玻璃板,然后略用力沿垂直方向擦拭。重復(fù)三次這一清洗過程,每次均須換用干凈的紙,除去多余的粘合溶液。

  2、長版處理(換雙橡膠手套)

  (1)、用浸透硅烷的吸水紙仔細(xì)擦邊玻璃板表面。

  (2)、5-10min后,用浸透95%乙醇的干凈吸水紙輕輕擦去多余硅烷(硅烷不能過量,否則影響印染效果)。(3)、用0.4mm邊條裝配好,再用膠帶粘好,用夾子夾好以防滲漏。

  (4)、將板呈40°角傾斜,按下面的比例直接混合溶液,然后用燒杯直接灌膠,或用50mL注射器注入,避免出現(xiàn)氣泡(氣泡出現(xiàn),可敲擊玻璃板,使之排出)。

  6%變性聚丙烯酰胺凝膠貯液90mL,四甲基乙二胺(TEMED)60μL,過硫酸胺90μL。灌滿后將鯊魚梳子背面插入液面5-6mm,將板放置20°角使之聚合。在室溫中約20min內(nèi)聚合(注意底部不要邊條,直接用膠帶封,否則邊條不易取出)。

  3、測區(qū)產(chǎn)物凝膠電泳(凝膠灌制后2-24h后均可獲得良好結(jié)果)

  (1)、去掉凝膠兩邊和底部膠帶紙,拔下鯊魚齒梳并轉(zhuǎn)過來用尖齒插入凝膠約1mm。將凝膠板安裝到電泳儀上,在電極上、下槽都倒入1×TBE電泳緩沖液,用吸管吹洗掉梳齒形成加樣孔中殘留的尿素,并去掉氣泡。

  接穩(wěn)定電源,40cm膠以1300V預(yù)電泳20-30min,是凝膠加熱到60℃左右。

  (2)、將G、A、T、C 4個小管,各加入3μLDNA測序反應(yīng)終止液,置于沸水中煮沸2min迅速插入冰中,上樣前,短暫離心混勻。

  (3)、關(guān)閉電源,上樣4μL。

  (4)、上樣后,繼續(xù)電泳,直至二甲苯藍(lán)染料距離玻璃板底部2cm時,終止電泳。

  4、DNA測序凝膠的銀染法處理

  (1)、玻璃板的分離:電泳結(jié)束后,小心揭開玻璃板,凝膠應(yīng)牢牢黏附在短板上。

  (2)、凝膠的固定:將凝膠連同放入磁盤中,加入固定液,注意要沒過凝膠,放置20min直至溴酚藍(lán)和二甲苯藍(lán)的顏色消失。緩緩水平搖動。固定液可回收做定影液。

  (3)、洗膠:用雙蒸水漂洗凝膠3次,每次2min。漂洗時輕輕搖動,每次前都將膠瀝干10-20s。

  (4)、凝膠的染色:加入染色液緩緩搖動染色30min(25min后可在另一瓷盤中備好顯影液,同時要預(yù)冷到10℃)。

  (5)、凝膠的漂洗:由于這一步非常關(guān)鍵,所以操作一定要非常快。將染色液倒入一個容器內(nèi),將瓷盤用雙蒸水涮一下,然后倒入3L雙蒸水,將凝膠浸入,然后將凝膠立即放入準(zhǔn)備好的預(yù)冷顯影液中(從膠浸入雙蒸水到放入顯影液不能超過5-10s,如超過則重復(fù)(4)(5)步)。

  (6)、凝膠的顯影:緩緩搖動,直到凝膠上顯條帶,一般為5-6min,時間不要過長,否則背景會過深(邊搖動,邊觀察,棕褐色條帶到一定強度后,馬上終止)。

  (7)、終止顯影:將等體積定影液直接加入顯影液,緩緩搖動2-3min(時間過長會使染色變淡)。

  (8)、凝膠的漂洗:用雙蒸水漂洗2次,每次2min。

  (9)、將凝膠放在空氣中干燥,識讀序列。

  4、BLAST比對、鑒定屬、種

  5、進(jìn)化樹的繪制

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