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生物分離實驗案例

時間:2024-03-11 23:00:13 生物/化工/環保/能源 我要投稿
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生物分離實驗案例

  生物分離工程實驗是一門應用性很強的課程,通過對這門課的學習,使得學生能夠系統掌握生物活性物質的提取、分離、純化和加工的整個流程,以下是小編為大家整理的生物分離實驗案例,歡迎閱讀與收藏。

生物分離實驗案例

  生物分離實驗案例 1

  實驗一:牛乳中酪蛋白的提取

  一、實驗目的

  1、掌握等電點法提取蛋白的基本原理及基本操作;

  2、掌握雙縮脲法測定蛋白含量的基本原理及基本操作。

  二、實驗原理

  酪蛋白是乳蛋白質中最豐富的一類蛋白質,約占乳蛋白的80~82%,酪蛋白不是單一的蛋白質,是一類含磷的復合蛋白質混合物,以一磷酸酯鍵與蘇氨酸及絲氨酸的羥基相結合。它還含有胱氨酸和蛋氨酸這兩種含硫氨基酸,但不含半胱氨酸。它在牛乳中的含量約為35g/L,比較穩定,利用這一性質,可以檢測牛乳中是否摻假。

  酪蛋白在其等電點時由于靜電荷為零,同種電荷間的排斥作用消失,溶解度很低,利用這一性質,經牛乳調到pH4.6,酪蛋白就從牛乳中分離出來。酪蛋白不溶于乙醇,這個性質被利用來從酪蛋白粗制劑中將脂類雜質除去。

  在乳制品加工或成品中,酪蛋白含量是一個常需測定的指標。常用于測定酪蛋白的方法是先將酪蛋白在等電點沉淀,再用凱氏定氮法測定。本實驗采用雙縮脲法測定酪蛋白。其原理為:蛋白質含肽鍵,肽鍵在堿性溶液中可與銅離子形成紫紅色化合物,在540nm波長處有最大吸收,其顏色深淺與蛋白質濃度成正比,而與蛋白質分子量及氨基酸組成無關。

  三、材料與試劑

  市售牛奶

  10mg/mL酪蛋白標準溶液(用0.1MNaOH配制)0.1MNaOH溶液、0.2MpH4.6的HAc-NaAc緩沖液

  雙縮脲試劑:稱取硫酸銅(CuSO4·5H2O)1.5g,加水100mL,加熱助溶;另稱取酒石酸鉀鈉(NaKC4H4O6·4H2O)6.0g、碘化鉀5g溶于500mL水中。兩液混勻后,在攪拌下加入10%NaOH300mL,后用水稀釋至1000mL,貯存于塑料瓶中。此液可長期保存,若瓶底出現黑色沉淀則需重新配制。

  四、操作步驟

  1、牛乳中酪蛋白的等電點沉淀

  用量筒量取25mL牛乳兩份分別置于50mL燒杯中,水浴加熱至40℃,在攪拌下慢慢加入到已預熱至40℃的等體積的0.2MpH4.6的HAc-NaAc緩沖液中,混勻,冷卻靜置30min沉淀酪蛋白后,3000r/min離心15min,棄上清液,收集沉淀。一份沉淀用于“除雜”步驟,另一份沉淀用0.1MNaOH溶液溶解并定容至100mL,用于“酪蛋白含量測定”步驟。

  2、除雜

  將上述沉淀搗碎,加入10mL95%乙醇,攪拌制成懸浮液。將此懸浮液傾于布氏漏斗中,抽濾除去乙醇溶液,再用10mL乙醚-乙醇混合液(1∶1)洗滌沉淀兩次,最后再用10mL乙醚洗滌沉淀兩次,抽干。

  將沉淀從布氏漏斗中移去,在表面皿上攤開揮干乙醚后,置烘箱中80℃干燥過夜,稱重(m1)。

  3、酪蛋白含量測定

  (1)標準曲線的繪制

  分別移取酪蛋白標準液0.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL于干燥試管中,不足1.0mL者用0.1MNaOH

  溶液補足1.0mL,然后分別加入4.0mL雙縮脲試劑,混勻,室溫下反應30min,測定540nm波長處吸光度。以酪蛋白質量(mg)為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

  (2)酪蛋白含量測定

  取―步驟1‖中樣品溶液1.0mL,加入4.0mL雙縮脲試劑,混勻,室溫下反應30min,測定540nm波

  長處吸光度,查標準曲線,求得酪蛋白質量。平行測定3次,求其平均值,并計算25mL牛乳中酪蛋白的質量(m2)。

  五、結果與討論

  1、牛乳中酪蛋白含量的計算

  含量(g/mL)=

  2、酪蛋白提取得率的計算

  得率(%)=

  m2?100

  牛乳體積(25mL)

  m1

  100%

  m2?100

  六、思考題

  1、為什么在等電點沉淀時需加熱至40℃?

  2、除雜時,能否將三種溶劑的順序顛倒?為什么?

  3、雙縮脲法測定蛋白的原理是什么?

  4、比較牛乳中酪蛋白測定含量與理論含量大小,并對測定結果進行討論。

  實驗二:大蒜細胞SOD酶的提取與分離

  一、實驗目的

  1、掌握SOD酶的提取、分離、檢測等一般步驟;

  2、掌握酶在提取過程中的兩個重要參數:回收率和純化倍數。

  二、實驗原理

  超氧化物歧化酶(SOD)是一種就有抗氧化,抗衰老,抗輻射和消炎作用的藥用酶。它可以催化超氧負離子(O-)進行歧化反應,生成氧和過氧化氫:2O2-+H2→O2+H2O2.大蒜蒜瓣和懸浮培養的大蒜細胞中含有較豐富的SOD,通過組合組織或者細胞破碎后,可用PH7.8的磷酸緩沖液體提取。由于SOD不溶于丙酮中,可用丙酮將其沉淀析出。

  鄰苯三酚在堿性條件下可迅速自氧化,釋放出O2-,生成帶色的中間產物,在325nm有最大吸收峰。鄰苯三酚自氧化產生的中間產物在40s-3min這段時間,生成物與時間有較好的線性關系。顏色深→SOD逐漸增多→顏色淺,即酶活力越大,顏色越淺。

  三、試劑和材料

  新鮮蒜瓣,市售

  磷酸緩沖液:0.05mol/L,pH7.8

  氯仿一乙醇混合溶劑:氯仿﹕無水乙醇=3﹕5(V/V)丙酮:用前冷卻至4~10℃

  0.1mol/LTris—HCl緩沖液(pH=8.2,內含2mmol/LEDTA)10mmol/LHCl

  45mmol/L鄰苯三酚(內含10mmol/LHCl)

  四、實驗步驟

  1、組織或細胞破碎

  稱取5g左右大蒜蒜瓣,置于研缽中研磨,使組織或細胞破碎。

  2、SOD的提取

  將上述破碎的組織或細胞,加入2~3倍體積(10-15mL)的0.05mol/L,pH7.8的磷酸緩沖液,繼續研磨攪拌20min,使SOD充分溶解到緩沖液中,然后在5000r/min下,離心15min,收集上清液得提取液。

  留出1mL備用,剩余提取液準確量取體積后進行下步實驗。3、除雜蛋白

  提取液加入0.25倍體積的氯仿一乙醇混合溶劑攪拌15min,5000r/min離心15min,去雜蛋白沉淀,收集上清液得粗酶液。

  留出1mL備用,剩余粗酶液準確量取體積后進行下步實驗。4、SOD的沉淀分離

  將上述粗酶液加入等體積的冷丙酮,攪拌15min,5000r/min離心15min,得SOD沉淀。

  將SOD沉淀溶于少量(5ml)0.05mol/LpH7.8的磷酸緩沖液中,再加水5mL,5000r/min離心15min,收集上清液,得SOD酶液。準確量取體積。

  將上述提取液、粗酶液和酶液分別取樣,測定各自的SOD活力和蛋白濃度。5、SOD活力測定

  參照李建武的《生物化學實驗原理和方法》,采用鄰苯三酚自氧化法測定SOD的`酶活力。鄰苯三酚在堿性環境中即可迅速發生自氧化作用,在自氧化過程中產生有色中間物和O2-自由基,反應開始后溶液逐漸變成黃色,在有超氧化物歧化酶存在時,由于它能催化O2-自由基與+H結合生成02和H2O2,從而阻止了中間產物的積累,降低了自氧化速率。中間產物在325nm時有強力的光吸收,采用分光光度計即可檢測。

  (1)鄰苯三酚自氧化速率的測定:

  在試管中按表1加入各試劑,加入鄰苯三酚后馬上計時,迅速搖勻倒入石英比色皿中,在325nm波長下,從第1分鐘開始,每隔30秒測一次光吸光度,測至第5分鐘。以吸光度為縱坐標,反應時間(min)為橫坐標繪制反應曲線,計算鄰苯三酚自氧化速率k0(直線斜率)。

  表1鄰苯三酚自氧化測定加樣表

  試劑

  0.1mol/LTris—HCl緩沖液(pH=8.2,內含2mmol/LEDTA)

  蒸餾水10mmol/LHCl

  45mmol/L鄰苯三酚(內含10mmol/LHCl)

  總體積

  加樣量(mL)校零管4.54.40.1——9.0

  測定管4.54.4——0.19.0

  (2)SOD酶活的測定:

  在試管中按表2加入各試劑,加入鄰苯三酚后馬上計時,迅速搖勻倒入石英比色皿中,在325nm波長下,從第1分鐘開始,每隔30秒測一次光吸光度,測至第5分鐘。以吸光度為縱坐標,反應時間(min)為橫坐標繪制反應曲線,計算加入SOD酶樣品后的鄰苯三酚自氧化速率k1(直線斜率)。

  表2SOD酶活測定加樣表

  試劑

  0.1mol/LTris—HCl緩沖液(pH=8.2,內含2mmol/LEDTA)

  蒸餾水10mmol/LHCl待測樣

  45mmol/L鄰苯三酚(內含10mmol/LHCl)

  總體積

  加樣量(mL)校零管4.54.30.10.1——9.0

  測定管4.54.3——0.10.19.0

  (3)酶活力測定

  酶活性單位定義為:在lml的反應液中,每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達50%時的酶量定義為一個

  活力單位。

  按下式計算樣品中SOD酶單位活力:

  k0-k1樣品液稀釋倍數

  50%反應液總體積?

  加入樣品液體積單位體積活力(U/ml)=k0

  活性單位定義體積

  總活力(U)=單位體積活力?樣品液總體積

  式中:反應液總體積=9mL;樣品液稀釋倍數=1;加入樣品液體積=0.1mL;活性單位定義體積=1mLl;樣品液總體積=實驗中各樣品實測體積。6、樣品中可溶性蛋白含量的測定

  從1mL備用的提取液、粗酶液、酶液中分別取0.2mL、0.4mL、0.5mL,按提取液50倍、粗酶液20倍、酶液10倍進行稀釋,分別測定稀釋液在260nm和280nm波長處的吸光值,按下式計算可溶性蛋白的含量:

  蛋白質濃度(mg/mL)=(1.45A280–0.74A260)×稀釋倍數

  總蛋白(mg)=蛋白質濃度×樣品液總體積

  五、結果與討論

  將試驗結果及相應的計算結果填入下表:

  相關計算公式:

  力力;回收率=粗酶液(或酶液)總活比活力U/mg=總活力(U);純化倍數=粗酶液(或酶液)比活

  提取液總活力提取液比活力總蛋白(mg)

  六、思考題

  1、在SOD酶提取步驟中應注意的關鍵問題是什么?

  2、綜合評價蛋白或酶的提取分離流程優劣的指標有哪些?

  生物分離實驗案例 2

  茶多酚標準曲線的測定

  儀器:紫外分光光度計,比色皿,天平,容量瓶,移液管,pH計、試管

  藥品:沒食子酸丙酯或茶多酚,酒石酸鉀鈉,硫,沒食子酸丙酯,蒸餾水溶液,移入25mL容量瓶并稀釋至刻度,搖勻,配制成1mg/mL的標準溶液

  A酒石酸亞鐵溶液配制

  準確稱取0.1g硫酸亞鐵,和0.5g酒石酸鉀鈉,混合,蒸餾水溶解后移入100mL容量瓶,稀釋至刻度,搖勻。

  pH7.5磷酸鹽緩沖液配制

  磷酸氫二鈉:準確稱取分析純磷酸氫二鈉2.969g,蒸餾水稀釋溶解,移入250mL容量瓶,加水稀釋至刻度,搖勻,為a液

  磷酸二氫鉀:準確稱取分析純磷酸二氫鉀,、2.2695g,蒸餾水溶解,移入250mL容量瓶,定容,B。

  取A液體85mL,B液體15mL混合均勻,即成。

  B標準曲線繪制

  分別吸取0、0.25、0.50、0.75、1.0、1.25mL的沒食子酸丙酯標準液于25mL容量瓶中,加入蒸餾水4mL,再加入酒石酸亞鐵溶液5mL,用pH7.5的磷酸鹽緩沖溶液稀釋至刻度,搖勻,分光光度計在540nm處,1cm比色皿,分別測定吸光度。空白參比操作同上,不加沒食子酸丙酯。以容量瓶中沒食子酸丙酯的`絕對含量mg為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線,做線性回歸。

  C樣品測定

  取適量樣品加入容量瓶,操作同上,沒食子酸丙酯含量乘以換算系數1.5,求得茶多酚。

  實驗二超聲法和回流法提取茶多酚的比較

  實驗儀器:

  超聲提取器、布氏漏斗、抽濾瓶、真空泵、燒瓶、量筒、分光光度計、比色皿、容量瓶等、實驗試劑

  茶葉、純凈水、茶多酚(沒食子酸丙酯)、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀等

  操作方法

  1、材料準備

  稱取一定量的茶葉,研缽粉碎。備用

  2、提取

  A、超聲提取法

  稱取5g粉碎后茶葉末,放入燒瓶(塑料袋密封),加入100mL水,于超聲提取器,50℃提取20min,抽濾,定容至100mL,待測。

  B、回流提取法

  稱取10g粉碎后茶葉末,放入圓底燒瓶,加入100mL水,80℃提取40min,分別在1、3、5、7、10、15、20、30、40min取3mL樣品,小漏斗過濾后,待測。測得茶多酚含量(mg/mL)以茶多酚含量為縱坐標,時間為橫坐標繪制曲線。

  3、含量測定

  按照標準曲線的方法測定含量。

  所需試劑及儀器

  試劑:

  沒食子酸丙酯或者茶多酚,酒石酸鉀鈉,硫酸亞鐵,磷酸氫二鈉,磷酸二氫鉀,儀器:

  紫外分光光度計,水浴鍋,電子天平,pH計,超聲提取器,量筒(100mL*1),容量瓶(25mL*8,100mL*4,250mL*2),比色皿*5,移液管(1.0mL*2,0.5mL*2,2mL*2,5mL*4)三角瓶250mL*2,小漏斗*2,試管架

  生物分離實驗案例 3

  一、實驗目的

  1. 學會提取和分離葉綠體中色素的方法。

  2. 比較、觀察葉綠體中四種色素:理解它們的特點及與光合作用的關系

  二、實驗原理

  光合色素主要存在于高等植物葉綠體的基粒片層上,而葉綠體中的色素能溶于有機溶劑中。故要提取色素,要破壞細胞結構,破壞葉綠體膜,使基粒片層結構直接與有機溶劑接觸,使色素溶解在有機溶劑中。

  葉綠體中的色素有四種,不同色素在層析液(脂溶性強的有機溶劑)中的.溶解度不同,因而隨層析液的擴散速度也不同。

  三、材料用具

  取新鮮的綠色葉片、定性濾紙、燒杯、研缽、漏斗、紗布、剪刀、小試管、培養皿、毛細吸管、量筒、有機溶劑、層析液(20份石油醚、2份丙酮、1份苯混合)、二氧化硅、碳酸鈣。

  四、實驗過程(見書P54)

  1.提取色素:

  2.制備濾紙條:

  3.色素分離,紙層析法。(不要讓濾液細線觸及層析液)

  4.觀察:

  層析后,取出濾紙,在通風處吹干。觀察濾紙條上出現色素帶的數目、顏色、位置和寬窄。結果是:4條色素帶從上而下依次是:胡蘿卜素(橙黃色)、葉黃素(黃色)、葉綠素a(藍綠色)、葉綠素b(黃綠色)。

  五、討論

  1.濾紙條上的濾液細線為什么不能接觸到層析液?

  2.提取和分離葉綠體中色素的關鍵是什么?

  生物分離實驗案例 4

  一、實驗目的

  1. 初步學會觀察植物細胞質壁分離和復原的方法。

  2. 理解植物細胞發生滲透作用的原理。

  二、實驗原理

  當細胞液的'濃度小于外界溶液的濃度時,細胞液中的水分就透過原生質層進入外界溶液中,使細胞壁和原生質層都出現一定的收縮。由于原生質層比細胞壁的收縮性大,當細胞不斷失水時,原生質層就會與細胞壁逐漸分離開,也就是分升了質壁分離當細胞液的濃度大于外界溶液的濃度時,外界溶液中的水分就透過原生質層進入細胞液中,整個原生質層就會慢慢地恢復成原來的狀態,使植物細胞逐漸發生質壁分離復原。

  三、材料用具

  紫色洋蔥鱗片葉、顯微鏡、載玻片、蓋玻片、滴管、鑷子、刀片、吸水紙、清水、0.3g/ml蔗糖溶液

  四、實驗過程(見書P60)

  物理實驗報告 ——化學實驗報告 ——生物實驗報告 ——實驗報告格式 ——實驗報告模板

  五、討論

  1.如果將洋蔥表皮細胞浸潤在與細胞液濃度相同的蔗糖溶液中,這些表皮細胞會出現什么現象?

  2.當紅細胞細胞膜兩側的溶液具有濃度差時,紅細胞會不會發生質壁分離現象?為什么?

  3.畫一個細胞在正常狀態下到經過0.3g/ml蔗糖溶液處理,再經過清水處理的細胞變化的一系列模式圖。

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